Международный центр биотехнологий "BIOMEDSTEM"

Cтволовые клетки

Каждый человек на самом начальном этапе жизни переставляет собой одну единственную клетку, которая образовалась в момент оплодотворения яйцеклетки сперматозоидом (см. схему).

Из этой клетки – зиготы - в дальнейшем образуется все, что есть в нашем теле. Клетки продолжают делиться и через несколько суток формируется ранний эмбрион – бластоциста, состоящий из нескольких десятков эмбриональных стволовых клеток.

Эмбриональные стволовые клетки (источник: Kyoto University)

Именно эти клетки дают начало следующему поколению стволовых клеток – гемопоэтическим (ГСК) и стромальным (мультипотентным мезенхимным стромальным клеткам, ММСК), о чем мы поговорим ниже. Поскольку выполнение аборта в столь раннем сроке беременности невозможно, эмбриональные стволовые клетки можно получить исключительно в лабораторных условиях путем оплодотворения в пробирке. Кроме того, в их получении нет особой необходимости, так как гораздо проще «добыть» гемопоэтические и стромальные стволовые клетки, из которых уже сейчас можно вырастить практически все, что необходимо.

Александр Александрович Максимов, русский гистолог и эмбриолог, в начале XX века предположил, что в кроветворных тканях должны существовать стволовые клетки, родоначальники эритроцитов и других клеток крови. Позже, его последователи, развили и сформировали концепцию стволовых гемопоэтических клеток. ГСК имеют огромное значение для нормального функционирования организма, поскольку дают начало клеткам крови и иммунитета человека.

Клетки крови, в частности, эритроциты осуществляют доставку кислорода всем органам и тканям. Иммунные, или барьерные клетки, обеспечивают защиту организма от «непрошенных гостей» - вирусов и бактерий, а также опухолевых клеток. Соответственно, гемопоэтические стволовые клетки применяют при заболеваниях крови (тяжелые анемии, лимфогранулематоз и другие лимфомы) и различных иммунодефицитных состояниях. В частности, для комплексного лечения рака различных органов и других онкологических заболеваний, тяжелых инфекций и септических состояний, а также для борьбы с синдромом хронической усталости. Немаловажно, что в эксперименте из гемопоэтических стволовых клеток удалось получить клетки сердечной мышцы и эндотелия (внутренней стенки сосудов).

В периферической крови ГСК представлены в очень малом количестве. Поэтому требуется стимуляция их выброса из костного мозга при помощи специальных препаратов, так называемых колониестимулирующих факторов. Высокая стоимость ограничивает данный способ забора стволовых клеток теми клиническими случаями, когда от их применения зависит жизнь человека, например, при тяжёлых опухолевых заболеваниях крови.

Наиболее надёжным, безопасным, безболезненным и дешевым способом забора гемопоэтических стволовых клеток является ее получение из пуповинной крови сразу же после рождения ребёнка и отделения плаценты с последующим хранением «про запас» в криобанке. Проблема состоит в том, что такая возможность предоставляется только один раз в жизни; поэтому стоит не упустить уникальный шанс застраховать здоровье своего ребёнка с первых дней его появления на свет.

К счастью, в организме человека есть место, где гемопоэтические стволовые клетки представлены в сравнительно больших количествах – это костный мозг, из которого они могут быть получены в количестве достаточном для культивирования с целью хранения в криобанке или последующего клинического применения.

ГСК (источник: Stowers Institute for Medical Research)

Стромальные стволовые клетки являются одними из наиболее перспективных, с точки зрения возможности клинического применения, типов стволовых клеток. Впервые их открыл и описал советский гистолог и гематолог Александр Яковлевич Фриденштейн в 1970-х годах Они обладают врождённым свойством дифференцироваться в различные клетки соединительной ткани, включая костную хрящевую и жировую ткани, и применяться для реконструкционной хирургии данных типов ткани. При определённых условиях можно направлять дифференцировку ММСК по неродственным путям: например, дифференцировать в нейроны, кардиомиоциты и др. типы клеток. Благодаря широкому спектру секретируемых ММСК факторов роста, сигнальных молекул и других биологически активных веществ они способны мобилизовать другие типы клеток для регенерации повреждённой ткани, например в печени, мышцах, поджелудочной железе и т.д. Особо следует отметить способность ММСК секретировать вещества, способствующие росту сосудов микроциркуляторного русла, в зонах, страдающих от недостатка притока крови. Это позволяет применять эти стволовые клетки при ишемических состояниях, таких как инсульт головного мозга, инфаркт миокарда, глубокая ишемия нижних конечностей и т.д. Уникальной является способность ММСК осуществлять иммунную модуляцию: нейтрализовать аутоиммунные процессы; блокировать реакцию отторжения трансплантата организмом реципиента и т.д.

Главным источником получения ММСК является костный мозг, однако данный тип клеток, но в меньших количествах можно получать из жировой ткани, тканей пуповины, плаценты и других тканей.

ММСК (эксплантация из костномозгового фрагмента)

Во взрослом организме обновление и восстановление всех тканей зависит от соматических стволовых клеток, и ткани глаза не составляют исключение. Исследователи доказали, что между прозрачной роговицей и склерой расположен так называемый роговичный лимб. Лимб представляет тонкую полосу, проходящую по границе роговицы и склеры. В этой области глаза были обнаружены прогениторные клетки, что открывает большие возможности в клеточной терапии офтальмологических болезней. Стволовые клетки лимба участвуют в регенерации повреждённого эпителия и способствуют восстановлению фоточувствительности. В нормальных физиологических условиях лимбальные стволовые клетки обеспечивают эпителиальный гомеостаз. Однако при травматических повреждениях вследствие термических и химических ожогов, поражение роговицы из-за применения контактных линз, синдрома Стивенса-Джонсона и глазного пемфигоида возникает дефицит или полное отсутствие лимбальных стволовых клеток. Это состояние приводит к отслоению эпителия роговицы. При этом развиваются воспалительные реакции, помутнение роговицы, возникает повышенная чувствительность к свету, что в конечном итоге приводит к слепоте. При пересадки донорской роговицы возникает проблема отторжения трансплантанта.

Более 20-ти лет офтальмохирурги используют трансплантацию культивированных лимбальных стволовых клеток. Эти клетки обладают иммуномодулирующими свойствами и способствуют быстрой реэпителизации, что способствует восстановлению функции глаза. Инновационным методом в повреждённую поверхность глаза при дефиците стволовых клеток является введение культивированных лимбальных стволовых клеток на подходящей подложке (амниотическая мембрана). Для этого процесса необходим минимальный биопсийный фрагмент со здорового глаза. По окончанию культивирования который вживляют в здоровый глаз.

Лимбальные стволовые клетки на внутренней поверхности линзы
Амниотическая мембрана

Известно, что человеческие органы состоят из миллионов клеток, соединённых между собой. Этим универсальным биологическим «цементом» является рыхлая соединительная ткань, важнейшим компонентом которой являются фибробласты. Именно фибробласты вырабатывают вещества межклеточного матрикса (например, предшественники коллагеновых, эластических и ретикулярных волокон) – среды обитания специализированных клеток. Кроме того, фибробласты выделяют специальные факторы роста, стимулирующие регенерацию (восстановление) специализированных клеток.

Поскольку фибробласты вездесущи, их легко извлечь из человеческого организма. Достаточно взять относительно небольшой участок кожи, и, проведя ряд биотехнологических этапов, получить большое количество необходимых клеток. Можно выделять фибробласты и из жировой ткани, оставшейся, например, после косметологической операции. Скорость роста фибробластов достаточно велика, однако с возрастом и вследствие многих болезней активность делений существенно снижается.

В клинической практике фибробласты чаще всего применяют для восстановления дефектов тканей – для лечения ожогов, ран, язв, свищей, а также в косметологии с целью улучшения свойств кожи. Уникальные «каркасные» свойства фибробластов используются при создании сложных трёхмерных биоинженерных структур, например, искусственного мочевого пузыря, искусственных сосудов, трахеи, апоневроза и т.д.

Фибробласты человека

Кератиноциты составляют основу эпидермиса – видимой части кожи человека, где они образуют многослойную конструкцию. Они относятся к числу высокодифференцированных (специализированных) клеток. Основная задача эпидермиса – защитить организм от неблагоприятных внешних воздействий, в том числе, от проникновения инфекции. По мере созревания, кератиноциты перемещаются из нижних слоёв в верхние и, в конце концов, отпадают в виде роговых чешуек, уступая место новым поколениям клеток.

Таким образом, кератиноциты могут быть получены только из эпидермиса кожи. Культивировать их вне организма сложнее, чем, например, фибробласты. Для этого необходимо использовать многочисленные факторы роста и специальные питательные среды. Из-за сложностей культивирования и выраженного «индивидуализма» в клинике используются чаще всего аутологичные (собственные) кератиноциты. Тщательное соблюдение специальных протоколов культивирования и пересадки этих клеток позволяет новому эпидермису выполнять функции здоровой кожи уже через 7-12 дней. При этом эстетически искусственно выращенная кожа выглядит гораздо лучше пересаженной с других участков тела.

Искусственно выращенные кератиноциты незаменимы при обширных ожогах кожи. Кроме того, эти клетки используются на завершающем (эстетическом) этапе лечения рубцов различного происхождения, а также после удаления татуировок, пигментных пятен и пр.

Кератиноциты эпителия кожи человека

Остеобласты – это клетки костной ткани, из которой сформирован скелет человека. Эти клетки «вмурованы» в губчатую соединительную ткань. В процессе жизнедеятельности они откладывают вокруг себя белковые и минеральные вещества, определяя уникальные свойства кости – прочность и упругость, а также обеспечивают способность кости к срастанию после переломов.

Выделить остеобласты из уже сформированной кости крайне сложно, поскольку химические вещества, используемые для устранения минералов, губят и сами клетки. Естественным «банком» остеобластов является костный мозг и надкостница – покровная пластина кости. Однако, в отличие от стволовых клеток, это не имеет практического значения, так как зрелые остеобласты вне организма (в культуре) делятся медленно и неохотно. Поэтому, оптимальным путём получения больших количеств остеобластов, является их выращивание из стромальных стволовых клеток (ММСК) посредством направленной дифференцировки. Применение данной биотехнологической процедуры позволяет значительно ускорить созревание остеобластов и, соответственно, начало проведение клеточной терапии.

Остеобласты различной степени зрелости, полученные из стромальных стволовых клеток, используются для лечения различных заболеваний опорно-двигательного аппарата человека: например, лечении ложных суставов и длительно не срастающихся переломов, а также, в случаях замещения дефектов кости после удаления опухолей и др. болезнях.

Остеобласты (источник: ATCC)

Хондроциты – это клетки хрящевой ткани. Они участвуют в формировании лицевого скелета (ушные раковины, перегородка носа, веки и т.д.), а также в составе специального хряща с низким коэффициентом трения служат своеобразной «прокладкой» между костями в суставах для их безболезненного движения.

Источником получения хондроцитов могут служить фрагменты хрящевой ткани из перегородки носа, реже – из ушных раковин после косметологических операций. Хондроциты, пригодные для восстановления суставных поверхностей, получают путём взятия небольшого кусочка хряща из здорового крупного сустава с использованием эндоскопической техники. Понятно, что все эти варианты забора весьма обременительны для пациента. Поэтому были разработаны методы направленной дифференцировки стромальных стволовых клеток в хондроциты. Эти методы сложные и дорогие, но гораздо менее травматичны и очень эффективные в ситуациях, когда необходимо быстрое восстановление хрящевой ткани.

Хондроциты могут использоваться для замещения дефектов хрящевой ткани суставов различного происхождения. В последнее время данный биологический продукт стал применяться в косметологии для пластики ушных раковин, хрящевой части носа, век и др. процедур.

Хондроциты (источник: Wikicell)

Сахарный диабет относится к числу наиболее распространённых и тяжёлых заболеваний. В его основе лежит неспособность вырабатывать инсулин специальными бета-клетками клетками поджелудочной железы. Дефицит инсулина приводит к увеличению уровня глюкозы в крови, поскольку она перестаёт усваиваться тканями.

Одно из направлений клеточной терапии сахарного диабета заключается в трансплантации донорских бета-клеток. Однако получить эти клетки в зрелом виде можно только из поджелудочной железы. Интересно, что современная страница истории клеточной терапии началась с пересадки бета-клеток поджелудочной железы, полученных из фетального (зародышевого) материала. Но многочисленные клинические исследования продемонстрировали, что введение данного биологического препарата даёт кратковременный эффект снижения уровня глюкозы. Дело в том, что бета-клетки обладают очень высоким уровнем специализации и иммунными свойствами, не совместимым с чужим организмом. Это обстоятельство не позволяет также использовать бета-клетки животного происхождения или взятые у людей, погибших в результате травм. Кратковременно эффективным оказалось и введение чужеродных бета–клеток с параллельным применением лекарств для торможения реакции отторжения (иммуносупрессивной терапии). Другими словами, риски лечения всегда оказывались сопоставимы, а в некоторых случаях даже превышали тяжесть самого заболевания.

Многими учёными предпринимались попытки получить бета-клетки путём направленной дифференцировки их «близких родственников» - клеток протоков поджелудочной железы. На этом пути уже достигнут определённый прогресс, однако тут же встаёт вопрос о способах получения протоковых клеток, поскольку их забор технически гораздо сложнее, чем самих бета-клеток.

Учитывая вышеизложенное, наиболее перспективным считается получение аутологичных (собственных) бета-клеток из стромальных стволовых клеток методом направленной дифференцировки. Данные разработки проходят экспериментальный этап и пока не применяются в клинике.

Изолированные островки Лангерганса (источник: Massachusetts General Hospital)

Здоровая печень взрослого человека состоит из 100 миллиардов клеток, 65% из них – гепатоциты. Именно гепатоциты избавляют организм от основной массы токсинов, шлаков, продуктов распада белка и других химических соединений, перерабатывая их в ходе сложных биохимических реакций в нетоксичные вещества. Поэтому состояние этих клеток во многом определяет резервы человеческого организма с точки зрения способности противостоять неблагоприятному воздействию внешней и внутренней среды.

Зрелые гепатоциты можно получить только путём взятия небольшого участка печёночной ткани. Культивирование зрелых гепатоцитов трудновыполнимо, в то время как направленная дифференцировка (транс-дифференцировка) стромальных стволовых клеток позволяет получить большое количество клеток печени. Поэтому наиболее перспективным для клинической практики является использование в качестве исходного материала собственных стромальных стволовых клеток.

Искусственно выращенные гепатоциты используются в лечении различных заболеваний, связанных с поражением ткани печени (циррозы различного происхождения, хронические  гепатиты). Эти клетки можно применять в ситуациях, когда необходимо временно активизировать "обеззараживающую" функцию организма (отравления, тяжёлые инфекции и др.)

Гепатоциты человека (источник: University of Kansas Medical Center)

Сердце человека состоит главным образом из особых мышечных клеток – кардиомиоцитов, которые, без преувеличения, можно назвать «рабочими лошадками» организма. Дело в том, что, ритмично сокращаясь, кардиомиоциты обеспечивают работу сердца как насоса по перекачке не менее 5 тонн крови в течение суток. Каждый кардиомиоцит состоит из большого числа переплетающихся между собой нитей – миофибрилл. Между миофибриллами располагается ядро клетки, сократительный аппарат, митохондрии, а также система внутриклеточных мембран.

Без сомнения, забор кардиомиоцитов из сердечной мышцы является очень опасной процедурой. В то же время попытки выделить клетки скелетной мышцы и ввести их в поражённый участок сердца не привели к существенным результатам. Поэтому в экспериментах на животных разработаны технологии применения предшественников сердечных клеток – кардиомиобластов, которые получают путём направленной дифференцировки как эмбриональных стволовых клеток, так и стромальных стволовых клеток. Как показали исследования, важно точно выбрать момент введения, когда стромальные стволовые клетки уже приобрели некоторые свойства кардиомиоцитов, но при этом все ещё остаются достаточно пластичными для эффективного «встраивания» в зону поражения. Данный тип клеточной терапии кардиопатологий находится на стадии доклинических и клинических испытаний.

 

Основным структурным элементом нервной системы является нервная клетка, или нейрон. С помощью нейронов осуществляется передача информации от одного участка нервной системы к другому, а также обмен информацией между различными органами. В нейронах формируются ответные реакции организма (рефлексы) на внешние и внутренние раздражители. Наконец, нейронные сети осуществляют сложнейшие процессы обработки информации, формирующие человеческое сознание.

Основные источники получения терапевтических нервных клеток – это эмбриональные ткани человека. Однако исследования последних лет продемонстрировали новые уникальные возможности образования нервных клеток из их предшественников – нейробластов, которые, в свою очередь, можно получить из стромальных стволовых клеток с помощью направленной дифференцировки.

В результате доклинических и клинических испытаний было продемонстрировано, что выращенные в лабораторных условиях нейробласты и нейроны способны приостанавливать нейродегенеративные процессы, и даже восстанавливать первоначальную функцию нейральных структур: например, при болезнях Паркинсона, Альцгеймера, мышечной дистрофии, рассеянном склерозе, мозжечковой дегенерации и др. подобных заболеваниях и травмах нервной системы.

Нейробласты (источник: ATCC)

Внутренняя стенка всех сосудов (артериальных, венозных, лимфатических), а также полостей сердца выслана высокоспециализированными клетками – эндотелиоцитами. Они участвуют в процессах переноса питательных веществ и кислорода из крови в органы и ткани. Кроме того, эндотелиоциты вырабатывают биологически активные вещества, влияющие на тонус сосудов, свёртывание крови и регуляцию обмена холестерина. При их повреждении изменяются свойства сосудов в целом, что проявляется в утолщении их стенок, развитии атеросклероза, формировании внутрисосудистых тромбов и т.д. Эндотелию принадлежит важная роль в осуществлении воспалительного процесса и «отражения инфекционного нападении».

Существует два основных способа получения эндотелиоцитов. Первый - из "второстепенного" сосуда, когда вначале механическим путём отделяется внутренняя оболочка, а затем из неё получают эндотелиоциты. После ряда биотехнологических этапов, выращенную культуру вводят в поражённую сосудистую зону с целью замещения погибших клеток. Однако следует учитывать, что свойства эндотелиоцитов будут зависеть от типа сосуда, из которого они были получены. То есть «венозные» эндотелиоциты несколько отличаются от «артериальных», а артериальные из крупных сосудов - от таковых, «живущих» в сосудах меньшего диаметра. Поэтому самым оптимальным является искусственное выращивание молодых (незрелых) эндотелиоцитов, которые способны приспособиться к индивидуальным параметрам повреждённых сосудов. Наилучшие результаты получены при использовании направленной дифференцировки стромальных стволовых клеток в клетки эндотелия. Культивирование эндотелиоцитов имеет ряд особенностей, которые заключаются в применении специальных факторов роста и использовании биореакторов, обеспечивающих постоянный поток и давление питательной среды.

В клинической практике клетки эндотелия используют в тех случаях, когда необходимо улучшить кровоснабжение и, соответственно, питание любой ткани или органа. Это особенно важно при ишемической болезни сердца и облитерирующих поражениях нижних конечностей.

Эндотелиоциты